基因檢測
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非整倍性的植入前基因檢測
非整倍性的植入前基因檢測

  在體外受精是已經轉化的不孕藥領域的技術。在過去的幾十年中,盡管出現許多與試管嬰兒相關的干預措施,但與引入植入前基因檢測相比,無論是專業人士還是整個社會,很少有人獲得更多的關注。PGT當前最常用的應用是通過非整倍性測試。在人類懷孕自發流產都記錄到與染色體非整倍高度相關。非整倍性是繁殖障礙的整個自然界最常見的原因。引入PGS可以最大程度地減少進行IVF的不育患者人群中的非整倍體妊娠。PGS是一種程序,其中可以從培養的早期胚胎中對細胞進行活檢,并在子宮轉移之前測試其染色體互補性。因此,PGS試圖鑒定整倍體胚胎以用于子宮轉移,從而既增加了植入率又降低與IVF相關的流產率。在過去10到15年中,與PGS相關的數據變化很大。通常,從5-10年前的PGS試驗獲得的數據與最近幾年進行的PGS試驗產生的數據顯著不同。這些差異很可能是由于PGS的應用隨著時間的推移獲得巨大的進步以及測試胚泡的能力。這篇綜述將簡要概述PGS的發展以及當前的使用建議。此外,本文還將概述當前用于執行PGS的各種技術,以及它們的相對優缺點。
   1990年,第一個成功的PGT程序由AlanHandyside博士進行。該病例利用Y染色體的鑒定來降低已知患有X連鎖隱性疾病的孩子在母親中的機會。后不久這種情況下,遺傳學家開始嘗試從卵裂期胚胎是單個卵裂球或極性體[使用熒光原位雜交三條染色體PGS。這樣做是為了減少自發流產或遺傳綜合征嬰兒的風險。隨著時間的推移,FISH用于鑒定非整倍體為12組或更多的染色體。這些早期技術的初步數據在生殖醫學領域引起了極大的興趣。然而,在2007年發表在新英格蘭醫學雜志的前瞻性和隨機研究未能表現出與PGS相關的懷孕率增加。繼這份報告之后,其他研究未能證明PGS對妊娠結局有好處。隨后,包括美國生殖醫學學會,美國婦產科學院和歐洲人類生殖與胚胎學學會在內的多個主要專業學會都發布了正式意見,這些意見阻礙PGS的普遍使用。在利用卵裂期胚胎和極體活檢進行的與FISH相關的令人沮喪的結果之后,遺傳學家,醫師和胚胎學家開始開發并利用可顯著改變PGS工藝的新工具和技術。當前執行PGS的方式取得幾項重大進步,促進了這種范式轉換,包括以下內容:1。同時評估所有23對染色體的倍性狀態的能力2。進行滋養外胚層活檢的能力3。活檢后玻璃化胚胎的能力,一個明顯益處利用23號染色體對評價在滋養外胚層階段PGS已被證明在多種前瞻性隨機試驗。此外,PGS活檢后使用胚胎玻璃化技術使PGS的處理過程具有更大的靈活性,從而導致該技術的利用增加,尤其是在美國。在研究證明PGS的益處評價患者人群有很多,包括復發性流產和不明原因的不孕癥。近年來,PGS的臨床利用率已經大大提高,并且這種趨勢在可預見的未來很可能會繼續。ASRM實踐委員會于2016年3月發表關于非整倍體植入前基因篩選的簡短交流。這表明“將PGS用作IVF的通用篩查測試可能顯示出更高的活產率,并增加選擇性單胚移植的利用率。”這是國際專業委員會的第一條建議,指出PGS具有較高的活產率,應考慮減少多胎妊娠。
   如前所述,與采用卵裂期或極體活檢的FISH評估相比,目前推薦使用PGP進行23染色體對評估并進行滋養外層活檢的方式,目前推薦進行PGS的方式存在幾個主要差異。這些差異中最顯著的也許是最新技術能夠可靠地識別所有23對染色體上的非整倍性。在FISH評價,只是染色體的離散數量可以評估,通常一次9-12染色體。妊娠失敗的早期流產數據表明,某些染色體比非整倍體妊娠更有可能涉及其他染色體。因此,在PGS的早期許多專家認為,專注于“問題染色體”將使他們能夠識別與非整倍性相關的主要染色體。然而,最近從胚胎DNA的23條染色體評估獲得的數據顯示,在所有23條染色體對中,非整倍性分布相對相等。因此,無法在所有23個染色體對中檢測非整倍性的技術在識別非整倍性方面處于明顯的劣勢,因為許多非整倍性錯誤將不會通過使用該技術進行評估而在染色體上進行。與在卵裂期或極體活檢中進行的活檢相反,滋養外胚層活檢的另一個重要進展是。這種變化導致結果成功的改善有幾個原因。這些原因中最相關的一個是胚胎鑲嵌癥。在許多胚胎中,有多種不同的細胞系-一種稱為鑲嵌癥的狀況。這意味著,所有單元格都源自共同的初始劃分的概念不能完全準確。因此,并非所有非整倍體錯誤都源于減數分裂的非分離,并且受精后必須發生一些倍性狀態變化。數據報道在卵裂發育階段的鑲嵌率高達50%。而嵌合并在滋養外胚層階段持續,嵌合的速率是顯著低,在發展早期階段近似3-5%,因此有可能在PGS期間進行活檢和測試的細胞可能無法代表構成胚胎的其他細胞的倍性狀態。鑲嵌術可能會導致臨床誤診,即使在已經進行準確的細胞遺傳學診斷的情況下,該結果也可能與臨床結果不匹配。從邏輯上講,與存在較高鑲嵌率的早期發育階段相比,胚泡階段存在較低鑲嵌率的滋養層活檢可以更準確地預測胚胎內的細胞優勢。除固有的較高的臨床誤診率外,卵裂期的PGS活檢與滋養外胚層活檢相比,對胚胎發育具有有害作用。評估卵裂期胚胎活檢的影響的數據顯示,顯著的發育滯后與活檢過程本身有關。因此,就診斷準確性和胚胎創傷而言,卵裂期活檢不如滋養外胚層活檢。
   即使評估在滋養外胚層階段進行的胚胎活檢并評估全部23對染色體,也不確定實現和維持妊娠的可能性。其他因素,例如線粒體拷貝數與核DNA的比例改變,表明胚胎處于應激狀態,從頭開始具有臨床意義的缺失或重復,自身免疫因素,子宮內膜容受性,內分泌異常,解剖異常或其他因素目前未知或不確定,可能在維持妊娠中起作用。但是,盡管事實上在植入和胎兒早期發育過程中涉及多個變量,但倍性狀態仍然是成功妊娠的重要且必要的組成部分。的是,雖然胎兒非整倍的發生率可與PGS可以減小PGS數據清楚地表明,它不能被完全利用現有技術在很大程度上是由于胚胎鑲嵌消除。當前的診斷技術測試注定要成為胎盤的細胞,而不是分化為胎兒的內部細胞團的細胞。出于對胎兒未來分化的擔憂,不建議對內部細胞團進行活檢。鑲嵌可以存在于構成滋養外胚層的細胞內。鑒定滋養外胚層中非整倍體或整倍體鑲嵌的能力提出重大挑戰,并且已經實施克服該問題的策略。一種策略是對大約5-10個細胞進行活檢,并使用能夠在此級別識別鑲嵌的檢測技術。但是,必須權衡從活檢過程中誘發的胚胎創傷,以決定如何積極地進行滋養外胚層活檢。改善IVF/PGS臨床結果的另一個重要因素是要了解,所有非整倍性的基因檢測都不相同。適當地驗證,所有遺傳技術將同樣識別“全染色體”非整倍體。然而,在除了提供全染色體非整倍體的一些遺傳技術也能夠識別大節段性染色體復制或缺失的。新的和增強的遺傳技術將提供全染色體非整倍體和大型節段性德爾斯或DUP的標識和線粒體的拷貝數,并且還可以同時識別從頭臨床顯著德爾斯和DUP的。因此,訂購醫生必須解“所有非整倍性測試技術都不相同。醫生應該對每種技術的利弊有一個清晰的認識,以便使患者獲得可行的懷孕和健康嬰兒的機會。
   許多生殖醫學醫師面臨的共同挑戰是在執行PGS測試時使用哪個基因診斷平臺和哪個公司。有某些診斷技術,例如FISH,根據當前醫學文獻不建議使用。能夠測試所有23對染色體的所有診斷測試平臺在識別整個染色體非整倍性方面具有可比的功效,但是在同時識別其他結構染色體異常或線粒體拷貝數方面的能力差異很大。此外,某些診斷測試平臺還可以同時測試染色體畸變和單基因突變。以下摘要概述了通常用于PGS基因診斷技術的每個平臺。在早期到2000年代中期,實驗室開始研發新技術提供的能力測試所有23雙非整倍體染色體,結構性染色體畸變同時測試。基因檢測有兩種主要類型的微陣列。這些是單核苷酸多態性和比較基因組雜交陣列。SNP和CGH之間的差異很大。對于這兩個微陣列平臺,必須通過提供整個基因組覆蓋范圍的某種類型的DNA擴增方案來溶解并擴增滋養外胚層細胞。與任何基因檢測一樣,診斷結果的質量始于擴增的DNA樣品的質量。SNP是基因組DNA中成對的單核苷酸對,它們在給定物種內高度可變。在PGS的背景下,所評估的SNP通常在基因組的非外顯子編碼片段中。在PGSSNP微陣列典型地評估大約300,000個SNP在整個基因組隔開。SNP陣列為每個分析的樣品提供一個基因型,并將結果與人類hapmap參考基因組進行比較。這些陣列可以識別整個染色體非整倍性,還可以識別整個基因組中大約250個常見的結構染色體畸變。但還有數百種從頭開始的結構染色體異常,這異常低于用于PGS的300,000個SNP陣列的分辨率,可能在植入,流產或生育患有嚴重遺傳綜合征的嬰兒中發揮重要作用。由于提供基因型信息,因此SNP陣列識別三倍體的能力有限,但可以識別單親二體性。如果分析足夠的滋養外胚層細胞,SNP陣列也可以識別鑲嵌。參考實驗室對用于PGS的SNP陣列的限制之一是,當夫妻有親戚關系時,它們的算法無法識別拷貝數。因此,如果兩個伴侶之間存在任何血緣關系,則不會報告非整倍性結果。
   CGH芯片的密度低于SNP芯片。用于PGS的aCGH芯片在整個基因組中有大約4000個標記。的aCGH是其中臨床樣品相對于正常46,XY和46,XXDNA樣品比標記方案。與SNP陣列相比,CGH陣列能夠在較短的時間內完成。CGH陣列平臺能夠在短短的12-15小時內擴增DNA并完成整個分析。與SNP陣列相比,這是一個重大優勢,SNP陣列需要大約30到40小時才能完成分析。沒有產生SNP陣列中產生的基因型,因此aCGH無法區分46,XX與69,XXX或46,XY與69,XXY。aCGH無法識別單親二體性。所有商業實驗室用于PGS的aCGH只能識別整個染色體非整倍性,并且沒有經過設計或驗證無法識別結構染色體畸變。如果aCGH芯片針對鑲嵌細胞樣本進行驗證,則aCGH確實不能鑒定滋養外胚層樣本內的鑲嵌性。aCGH的錯誤率大約為15%至30%。在實驗室進行的驗證研究中,通過對400多個滋養外胚層樣品中的下一代測序DNA與aCGH進行比較,結果表明一致性率大于99%。在該驗證研究中,通過aCGH在邊緣三體性19三體癥之間進行一次不一致診斷,該診斷被下一代測序診斷為正常。定量PCR或實時PCR是聚合酶鏈式反應測定,其可以通過檢測每個染色體的拷貝數識別全染色體非整倍性分析。它通過將每個染色體上的三個或四個基因座特異性擴增子與同一染色體上的參考基因進行比較來實現此目的。此測定法可容易地識別非整倍體用于以快速的方式所有23對染色體,但它是非常勞動密集和自動化強烈推薦。qPCR無法準確識別結構染色體畸變,但可以識別三倍體。由于定量PCR不產生基因型,它無法識別單親二體。可以包括一個單獨的實驗設計來檢測線粒體的拷貝數。下一代測序是需要優化的DNA擴增,以減少在擴增過程引入偽像的技術。DNA擴增后,可通過生物信息學軟件識別并去除偽影。
   當前有兩個主要平臺用于PGT。DNA擴增后,將每個DNA樣品約50ng酶解成數百萬個片段,并合并用于文庫制備。文庫制備是將所有DNA片段與銜接子和條形碼融合在一起的方法。健壯的文庫可產生代表性的,無偏差的核酸表示形式,對于準確的分子分析至關重要。文庫制備后,完成乳液PCR步驟或完成橋接PCR步驟。完成這些步驟后,DNA片段的實際測序存在顯著差異。
   對于MiSeq會發生基于光學的合成測序。PGM使用離子敏感場效應,當通過DNA合成進行測序時,可以檢測到由DNA聚合酶釋放的離子。這是基于每次加入核苷酸三磷酸時都會發生的氫離子的釋放。質子的釋放會導致pH值發生輕微變化,這會被敏感的傳感器檢測到。MiSeq和PGM都以大約1倍的深度對整個基因組進行測序,并將測序數據與人類hapmap參考基因組進行比較。這兩個平臺都允許一次同時分析22至60DNA樣品。兩個平臺均可在13至16小時內完成分析。進行測序分析后,MiSeq與PGM數據輸出和分析之間存在顯著差異。MiSeqDNA經過第一輪質量保證指標,然后使用BlueFuse軟件進行詳細分析。使用Torrent瀏覽器對PGMDNA輸出進行第一輪質量保證指標,然后通過IonReporter軟件進行詳細分析。MiSeq可以識別整個染色體非整倍性,但僅用于識別整個染色體非整倍性。如在技術公告規范使用關于MiSeq其VeriSeq基因組分析PGS指出,“VeriSeq僅旨在檢測全基因組非整倍性和馬賽克下降到50%的電平”。不應將其用于檢測任何結構染色體異常。MiSeq還可以識別線粒體拷貝數。與此相反,PGM分析可以識別全染色體非整倍體,大德爾斯或DUP的,且臨床顯著德爾斯或向下的DUP到大約800kb的分辨率為1MB。PGM還可以識別到大約20%的水平和線粒體拷貝數的鑲嵌。公平地說,一些使用MiSeq的商業實驗室確實報告較大的結構染色體異常和鑲嵌現象,含量低于50%。此外,使用PGM的實驗室僅報告非整倍性的拷貝數,沒有結構性染色體畸變或鑲嵌現象。PGM和MiSeq都可以測試單基因突變。由一個參考實驗室提供的另一種使用MiSeqNGS平臺的變體,稱為低密度NGS或LD-NGS,采用的NGS技術的分辨率低于該NGS技術。他們的DNA擴增方案不同于整個基因組擴增方案,因為它們在整個基因組中擴增大約10,000個基因組位點。完成后,將對這些擴增產物進行下一代測序。這種NGS方法論可在每個基因座處提供測序信息,但不能在每個基因座之間提供測序信息。此參考實驗室技術僅針對整個染色體非整倍性或臨床上顯著的dels或dups進行驗證。這種方法也無法檢測鑲嵌。如果大約50%的樣品是花葉,則將其分類為異常,而不是花葉異常。至關重要的是,推薦診斷平臺的醫療保健提供者必須了解可用的NGS技術之間的差異,并且絕對不能“假設”它們都是平等的。
   PGS是優化輔助生殖技術的強大新工具。在過去的十年中,PGS的執行方式已大大成熟和改進。當前的醫學文獻支持PGS在許多患者人群中改善ART結果的觀點。當前的建議支持使用進行PGS時通過滋養外胚層活檢評估在胚泡期所有23對染色體的倍性狀態的技術的使用。需要以直接比較的方式評估數據的未來研究,以更完整地定義PGS當前使用的不同診斷技術的相對優點。PGS正在成為通過輔助生殖技術提高妊娠成功率的最有價值的工具之一。新興的結果復雜性,尤其是在使用更復雜的工具的情況下,可能會導致在未來幾年中以不同的方式獲得PGS結果。由于在NGS結果中量化鑲嵌率,因此當沒有整倍體胚胎可用時,可以考慮將非存活染色體的鑲嵌轉移。可以想像在不久的將來給出PGS結果并確定所有鑲嵌率的時間,并且除了明確建議是否轉移外,還有一個“中間類別”,其中一些具有非整倍體或整倍體鑲嵌的胚胎當沒有整倍體胚胎時,可以考慮轉移。在這種情況下應就此類轉移的含義向患者提供廣泛的咨詢。同樣,倍性的類型將非常重要,可能使用非致命的非整倍體-整倍體鑲嵌體,例如考慮將胚胎隱匿在46,XX/46,XXY或46級,XY/47,XYY左右考慮進行子宮轉移的任何具有可行遺傳綜合征花葉的胚胎。如果沒有整倍體胚胎可用于轉移,還可以考慮所有致死性染色體的轉移。實驗室采用SNP和CGH微陣列,qPCR分析以及MiSeq和PGMNGS平臺。最終,應根據臨床和患者的需求來個性化選擇使用哪種診斷平臺。

 
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